过表达人LDH-C的CHO细胞株构建及其对乳酸代谢和细胞凋亡影响的研究

【摘要】重组蛋白药物因为其具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点，已成为医药产品中的重要组成部分，现已广泛的应用于治疗各种疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤等。但是生产能力不足已经成为重组药物发展的瓶颈，为满足不断扩大的市场需要，重组蛋白质产量的增加不仅仅通过扩大反应器的体积来实现，更重要的是通过细胞工程技术改造获得一个细胞生长周期长，产量高，代谢废物少、抗凋亡的细胞株。在CHO细胞生长过程中，特别是在分批培养过程的后期，乳酸积累是限制细胞密度的重要原因之一，乳酸还会导致培养基pH下降，而在生物反应器中为调整pH值添加碱性物质还会导致渗透压升高，进而对细胞的生长产生不利的影响，最终导致细胞活率以及蛋白产量的降低。LDH-C基因存在于精子细胞、睾丸细胞和某些肿瘤中，作为乳酸脱氢酶（LDH）的一个亚型，同乳酸脱氢酶A和B相比，LDH-C更偏向于利用乳酸作为底物，催化乳酸向丙酮酸方向发生反应。LDH-C有助于精子在高乳酸的环境中生存，同时它允许乳酸作为细胞能量的来源。虽然LDH-C在CHO细胞中的作用目前还不清楚，但是LDH-C可以作为细胞工程上的一个有趣的靶点，它可能会使CHO细胞代谢向有氧乳酸代谢方向转变，改善细胞生长的高乳酸环境。因此我们猜想在CHO细胞中过表达LDH-C基因可能会对改善细胞培养的高乳酸环境从而抑制细胞凋亡。本课题研究旨在通过在CHO细胞中过表达人LDH-C基因，改善细胞培养后期的高乳酸环境，从而减少高乳酸引起的细胞凋亡。本研究的意义在于为减少代谢副产物乳酸提供新的途径，为提高抗体或重组蛋白类药物的产量奠定基础。
【作者】靖钰；
【导师】郭亚军；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2014，硕士
【目的】在工程细胞CHO中过表达乳酸脱氢酶（LDH-C）基因，旨在利用基因工程手段构建出培养时间长、代谢副产物少、抗凋亡的细胞株，为抗体产量的增加奠定基础。
【方法】运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人SKBR-3细胞中扩增出LDH-C基因，经双酶切（XhoⅠ和HindⅢ）后与真核表达载体pcDNA3.0相连接，利用Lipo2000转染至CHO细胞，经G418加压筛选获得稳定表达LDH-C的单克隆细胞株。经Real-timePCR检测LDH-C基因在mRNA水平的表达量，挑选出三株表达量比较高的细胞株进行补料分批培养，通过对比实验组细胞CHO/LDH-C和对照组细胞CHO/pcDNA3.0的生长曲线、细胞活率以及IVCC曲线等参数，获得一株IVCC值最高的细胞。在三种不同的分批补料培养条件下，观察LDH-C对细胞生长的影响，每天记录细胞生长的密度，并用台盼蓝拒染法计算细胞的活率，同时每天检测细胞培养上清中代谢产物乳酸的含量，以研究LDH-C对CHO代谢的影响。对CHO/LDH-C进行细胞周期检测、AnnexinV与PI双染检测细胞凋亡率、JC-1染色检测两组细胞的线粒体膜电位以及western-blot检测细胞凋亡通路中的相关蛋白表达，以研究LDH-C对凋亡的影响。
【结果】（1）成功克隆人LDH-C基因，构建真核表达载体pcDNA3.0/LDH-C，并成功获得稳定转染的CHO/LDH-C细胞株。通过Real-timePCR鉴定、流加培养生长曲线以及酶活鉴定等实验获得一株LDH-C表达量较高，生长密度较高的6号克隆CHO/LDH-C#6作为后续实验的研究对象。同时，选取CHO/pcDNA3.0#4作为实验的对照组。（2）在初始培养条件下，两组细胞的生长无明显差别，但是在第三天分别加入40mM丙酮酸钠或者40mM乳酸钠后，对照组细胞的生长受到了抑制，而转染了LDH-C的实验组细胞生长密度显著高于对照组细胞，并且在这两种培养条件下实验组细胞的乳酸浓度明显低于对照组，特别是在流加培养的后期，LDH-C的作用更加显著，可以显著性降低乳酸浓度。（3）利用流式细胞仪检测细胞周期，结果显示转染后的CHO/LDH-C细胞S期增加，说明处于DNA复制期的细胞增多，增殖活性增加。流式检测细胞凋亡、western-blot以及线粒体膜电位检测均显示CHO/LDH-C细胞细胞凋亡降低，说明过表达LDH-C通过可以抑制CHO细胞的凋亡。
【全文结论】本课题成功构建稳定表达人LDH-C基因的CHO/LDH-C细胞，并在补料分批培养中通过添加乳酸及丙酮酸钠模拟高乳酸环境，研究了此基因过表达对CHO细胞在高乳酸环境下存活的影响，并对高乳酸引起的凋亡进行了研究。研究表明，在未添加乳酸或丙酮酸钠的低乳酸环境下，LDH-C过表达未改善细胞生长及活率。而在乳酸及丙酮酸钠添加条件下，LDH-C过表达的CHO细胞具有更高的细胞密度和细胞活率，而且其乳酸浓度与对照组相比显著降低。此外，LDH-C过表达的细胞具有更快的增殖以及更强的抗凋亡能力。
【关键词】中华仓鼠卵巢细胞；补料分批培养；LDH-C；乳酸；抗凋亡；

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